研究成果表明，mNGS和基于多重PCR的tNGS在细菌和真菌检测方面的性能相似；在检测DNA病毒方面，tNGS可能优于mNGS。两种NGS检测方法与PCR相比没有明显差异。本次研究成果的发表，为尊龙凯时人生就博官网登录诊断基于二代测序的病原检测产品应用，提供了坚实的研究数据支持。 论文发布截图
研究背景 肺部感染在全球范围内广泛流行，具有较高的发病率及死亡率，构成严重医疗负担。早期、准确的病原学诊断对制定针对性的抗生素治疗方案、降低病死率具有重要意义。通过检测BALF样本，可以较为便捷地诊断各种肺部疾病，包括肺部感染。 在临床上，BALF样本中病原体的鉴定主要基于传统的微生物培养、显微镜涂片和聚合酶链式反应(PCR)。 传统的微生物培养，被认为是感染性疾病病原体诊断的金标准，但它存在检测周期长，灵敏度低，检测非典型病原体、病毒和苛养微生物具有挑战性等缺点。镜检涂片的检出率同样较低，可供选择的检测靶标也较少。此外，PCR检测需要预设针对病原的特异性引物或探针，因此该方法只能检测已知病原体，在单次检测中检测病原体的能力有限。 近年来，二代测序(NGS)技术结合生物信息学已成为人类病原体检测、鉴定和分析的有力工具，为应对上述临床诊断挑战提供了新选择。 mNGS是一种不依赖培养、无需预设、无偏倚、全面的微生物检测和分类学鉴定方法，具有高灵敏度、广泛的病原体范围以及检测新出现病原体的能力，已被证明在肺部感染病原体的检测和鉴定中具有可行性。然而，mNGS仍面临诸多挑战，如成本高、人源基因干扰大、结果判读困难、无法同时进行DNA和RNA双流程检测等。 基于靶向扩增技术和高通量测序技术的tNGS应运而生。目前，tNGS似乎具有检测灵敏度不受人类基因组和背景微生物影响、检测成本更低、样本要求更低、工作流程易于标准化、可同时检测DNA和RNA病原体等优点。然而，基于多重PCR技术的tNGS在BALF样本中的病原体鉴定性能尚不清楚。
研究方法 本研究共收集85例疑似感染患者BALF样本。对每个标本均进行mNGS和tNGS工作流程，分别从样本维度、病原维度评价并比较mNGS和tNGS在病原体检测方面的性能。最后，用PCR方法对临床重点病原体的不一致鉴定结果进行验证。 研究结果
根据纳排标准，最初将来自83名患者的85份BALF样本纳入本研究。随后，2例样本未通过tNGS工作流程的QC过程。最后，83个样本被纳入进一步分析。
mNGS和tNGS病原体鉴定 mNGS和tNGS的微生物检测阳性率分别为95.18% (79/83)和92.77%(77/83)，差异无统计学意义(P =0.625)。 mNGS和tNGS病原体检测结果如图1所示，主要检测到细菌和DNA病毒。mNGS共检测到244种病原菌。细菌共31种，占检出总数的47.13% (115/244)；DNA病毒有6种，占检出总数的33.61%(82/244)；真菌15种，占18.85%(46/244)；寄生虫检出1例口腔毛滴虫，占0.41%(1/244)。 相比之下，tNGS从83份BALF样本中鉴定出270种潜在病原体。细菌共28种，占检出总数的40.00% (108/270)；DNA病毒8种，占40.74% (110/270)；RNA病毒8种，占9.26% (25/270)；共检出真菌8种，占10.00% (27/270)。
图1：mNGS和tNGS工作流程病原体鉴定结果
mNGS与tNGS结果比较 mNGS和tNGS检测病原体的一致性如图2所示。76例(91.57%，76/83)样本mNGS和tNGS检测均为阳性，3例(3.61%)两者均为阴性。76例双阳性样本中，9例mNGS与tNGS检测结果完全一致；60份样本的mNGS和tNGS检测结果部分一致，至少检测到1种相同的病原；其余7例样本mNGS与tNGS检测结果完全不一致。 因此，本研究纳入样本的mNGS和tNGS检测结果完全一致率为14.56%(12/83)，完全不一致率为13.25 %(11/83)，部分一致率为72.27%(60/83)。 图2：mNGS和tNGS检测病原体的一致性 图3比较了mNGS和tNGS检测每种类型病原、每种病原的阳性样本数量，并对不同panel范围和不同报出分类层级的病原进行了特殊标记。RNA病毒和寄生虫检出情况的差异是由不同的检测范围造成的。 对于细菌，总体阳性率差异无统计学意义。具体而言，两种工作流程均检测到的TOP3均为MTBC、流感嗜血杆菌和肺炎克雷伯菌，仅胞内分枝杆菌的检出率差异显著(P<0.05)，这是由分类学类别不同造成的。对于真菌，两种方法的TOP3真菌检出均为烟曲霉、白色念珠菌和耶氏肺孢子菌。病原体阳性率无显著差异，但由于检测范围和分类层级的差异，特定病原体检测的比例较高，导致mNGS的总体真菌阳性率显著高于tNGS(P<0.001)。 对于DNA病毒，除细环病毒不在tNGS检测范围内外，mNGS和tNGS检测到的病原谱一致，分别为人EBV、CMV、人疱疹病毒7型、人疱疹病毒6型、人疱疹病毒1型。另外，EBV(P<0.001)、人疱疹病毒7型(P <0.001)、CMV(P<0.05)和人疱疹病毒6型(P<0.01)的阳性样本数量具有统计学差异，且tNGS总是具有较高的检出率，这可能反映了mNGS和tNGS之间的性能差异。 图3：mNGS和tNGS检测病原体的结果比较 核心病原验证
基于mNGS和tNGS结果，对临床核心病原体结果存在差异的BALF样本进行PCR正交验证。如图4所示，mNGS和PCR的微生物检出率均高于tNGS，但mNGS和tNGS与PCR的总符合率相同，均为50%。
图4：关键病原体mNGS和tNGS检测结果不一致的PCR分析
研究总结
本研究系统评估了mNGS和基于多重PCR的tNGS在BALF样本中的病原检测性能差异。总体而言，mNGS和tNGS在检测细菌和真菌方面性能相近，而tNGS在检测DNA病毒方面可能优于mNGS。两种NGS检测方法与PCR相比没有明显差异。我们的研究结果为mNGS和tNGS的临床应用提供了有力的科学依据。
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